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ELISA预实验完整攻略
ELISA(酶联免疫吸附试验)预实验是开展正式实验前必不可少的环节,主要用于摸索合适的实验条件及确定实验的可行性。以下是ELISA预实验的开展过程,一起来看看吧!
一、预实验的目的
确定实验条件:如抗原或抗体的浓度、酶的种类和浓度、洗涤液的浓度和pH值等,以确保实验的准确性和可靠性。
确定实验范围:包括最佳反应时间和浓度范围,以确保在正式实验中获得最佳的实验结果。
验证实验方法:确保实验方法的准确性和可靠性。
减少实验误差:提高实验的重复性和可重复性。
二、预实验的方法
1.实验样本的选择:
预实验一般通过测定少数有代表性的样本来确定正式实验方案。通常,测定的样本会分为不同的组别,不同组别的样本由于前期处理或刺激后,靶标物的表达量会产生变化。建议从各组样本中随机选择1~2例样本。如果正式实验测定的样本数量多,分配到预实验的试剂量有限,那么至少选择两例样品,建议选用1例为理论上靶标物含量最低组的样品,另1例为理论上靶标物含量最高组的样品。
2.最适稀释倍数的确定:
①将样本梯度稀释,可根据样本中靶标物的浓度,选择2倍、5倍或10倍梯度稀释,同时测定标准品。
②标准品的制备需按照试剂盒说明书的要求,试剂量充足可以选择一条完整的标曲,试剂量有限也可以选择部分浓度点(如空白孔、最低浓度孔、中间浓度孔以及最高浓度孔)。
③将测定的不同稀释浓度的样本测定的OD值(光密度值)与梯度浓度标准品OD值进行对比,最佳稀释倍数为此倍数稀释后全部或绝大多数样本OD值能够位于标准曲线中间浓度孔对应的OD值,即标准曲线的最佳拟合区域。
④在做预实验时,一定要设置标曲,不设置标曲则无法通过比较确定最适稀释倍数。
3.抗原包被浓度的设定:
①将抗原溶液分别按照1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的浓度稀释在抗原包被液中。
②以等量随机选取的特异性抗体血清与抗原溶液反应,在37℃孵育1小时后清洗,然后加酶标二抗,孵育30分钟清洗,最后加底物显色,反应终止后用酶标仪在450nm波长下测定各孔的光密度值。
③绘制ROC曲线(受试者工作特征曲线),找出临界值。
4.酶标二抗稀释比例的确定:
①取已知阳性和阴性血清样本,分别用ELISA稀释液将特异性抗体稀释成不同浓度的酶标二抗溶液,与包被抗原孵育、清洗后加底物显色,最后用酶标仪测定光密度值。
②绘制ROC曲线,找出临界值。
5.显色时间的确定:
①显色是ELISA实验中最后一步温育反应,固定在酶标板上的酶催化无色底物生成有色产物。
②由于ELISA实验会受到环境差异及实验操作差异的影响,商业化的ELISA试剂盒通常不会推荐固定的显色时间,而是建议实验操作人员根据显色情况判断合适的显色反应时间。
③加入底物后可定时观察反应孔的颜色变化(如每隔5分钟观察一次),当标准孔的前3~4孔有明显的梯度蓝色,后3~4孔梯度不明显时,即可终止。通过预实验熟悉操作的同时,也能确定合适的显色时间。
三、注意事项
①在进行预实验时,应严格按照ELISA试剂盒的说明书进行操作,避免由于操作不当导致的实验误差。
②预实验的结果应认真记录和分析,以便为正式实验提供可靠的依据。
③在预实验过程中,如发现任何异常或不符合预期的结果,应及时查找原因并进行调整。
通过以上预实验的设置和操作,可以对ELISA实验的条件进行初步的摸索和优化,为后续的正式实验提供可靠的基础。同时,也能及时发现实验中存在的问题,进行针对性的改进,提高实验的准确性和可靠性。上海恒远生物专业提供生命科学领域的技术服务,提供全方位实验技术服务,为广大科研工作者大大节省了重复劳动的时间和精力,我们有过硬的技术咨询和完善的售后服务,购买ELISA试剂盒赠送免费代测服务,在线一对一技术指导,为您解决后顾之忧。
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