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免疫组化实验操作注意事项


免疫组化实验是一项精密的技术操作,需要严格把控各个环节以确保结果的准确性和可靠性。以下是免疫组化实验的关键注意事项:

一、血清封闭
血清封闭的目的是为了一抗与组织的非特异性结合,造成假阳性,一般会采用BSA、羊血清等封闭这些位点,封闭血清一般是和二抗同一来源的,室温封闭10-30min。

二、一抗和二抗浓度和孵育时间
不同的一抗浓度,孵育时间和温度等对染色结果往往有较大的影响。在4℃下,反应缓慢,背景较浅;而37℃反应较快,时间较短;室温介于两者之间,二抗一般室温孵育30min。

三、DAB显色
检测背景的深浅和特异性染色的深浅基本上都以DAB孵育条件决定。DAB的显色时间并不是固定的,主要方法是使用显微镜控制显色时间,到出现特异性染色较强且出现背景着色较浅时就可以冲洗。如果DAB显色时间过长(超过十分钟)才出现阳性染色,可能是一抗体浓度过低或者封闭时间过长,也可以加入金属离子来增强显色(如硫酸铜、氯化钴、硫酸镍铵等);如果DAB显色时间过短颜色就很深,这可能是一抗过高,需要下调抗体浓度,如果短时间内过深

四、复染
免疫组化染色后为了衬托出组织形态结构有必要进行复染,常用试剂为Mayer’s苏木染色,一般为2 min左右,DAB在核蛋白着色的时间可以适当缩短,最后用氨水或PH 8.0的TBS返蓝。

五、封片
在封片阶段我们通常是用中性树胶来进行,封片过程中注意斜靠盖玻片防止气泡的产生从而对结果进行营影响,建议最好在通风橱操作,这样有利于气泡排除干净,不影响后续的镜检。

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