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培养细胞的正确“姿势”
把细胞养好的三个关键要素是：良好的细胞来源，正确的实验操作，以及合适的培养体系。其中“合适的培养体系”就是要创造适合细胞生长的环境，给细胞建立一个满意的“家”。
一、基础操作流程与关键技术
1.细胞传代（贴壁细胞）
时机：当细胞汇合度达80%-90%时进行，过度密集会导致接触抑制（如成纤维细胞）。
步骤：吸弃原培养基→PBS润洗（去除残留血清）→加入胰酶消化（时间因细胞类型而异，通常1-5分钟）→加入含血清培养基终止消化→轻柔吹打形成单细胞悬液→按比例分装至新培养瓶。
注意事项：Raw264.7等敏感细胞需控制密度（70%-80%），传代比例建议1:4，避免过度消化导致细胞损伤。
2.悬浮细胞培养
无需消化，直接离心收集细胞后重悬分装。需定期监测细胞密度和活率，避免聚集。
3.冻存与复苏
冻存液：常用10%DMSO+90%胎牛血清，程序降温后液氮保存。
复苏：快速解冻后立即转移至含培养基的离心管，离心去除DMSO，减少毒性。
二、细胞培养基本条件
1.合适的细胞培养基
合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
2.优质血清
目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。
3.无菌无毒细胞培养环境
无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。
4.恒定的细胞生长温度
维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。
5.合适的气体环境
气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。
6.细胞培养温度
维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。
三、细胞状态判断与问题解决
1.形态观察
健康贴壁细胞：边缘清晰，贴壁均匀（如HEK293呈多边形）。
异常表现：颗粒增多、空泡化、脱落（可能因污染、消化过度或营养不足）。
2.常见问题处理
污染：立即丢弃并彻底消毒环境。细菌污染表现为培养基浑浊，真菌可见菌丝。
贴壁不良：检查培养瓶表面处理（如胶原包被）、血清质量或消化时间。Raw264.7细胞复苏后贴壁差可短暂离心增强附着。
生长缓慢：排查血清批次差异、培养箱CO₂浓度（通常5%）或细胞老化（原代细胞代次不宜过高）。
四、长期培养优化建议
1.个性化调整
不同细胞系需求差异大。例如，原代成纤维细胞偏好高血清（15%），而肿瘤细胞可能需特定生长因子。
记录每代细胞的形态和生长曲线，建立标准化操作手册。
2.辅助措施增强细胞活性
营养支持：补充抗氧化剂（维生素C、E）或胶原蛋白（皮肤细胞培养）。
物理刺激：适度振荡悬浮培养可改善氧气交换。
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